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解決方案 | 293T細胞培養攻略

細胞攻略

293T細胞培養

細胞特點


01.細胞貼壁能力比(bi)較弱(ruo)

293T細胞是貼壁細胞，但其貼壁能(neng)力(li)比較弱，容易出(chu)現明顯的成片脫落(luo)現象。比如：運輸低(di)溫及震蕩、在室溫條件下靜置時(shi)間過(guo)(guo)長、添加的培(pei)(pei)養基(ji)或其他試劑溫度(du)過(guo)(guo)低(di)、培(pei)(pei)養時(shi)細胞密(mi)度(du)過(guo)(guo)高(gao)、細胞聚集(ji)時(shi)未(wei)吹散、加液(ye)吹打時(shi)觸碰(peng)了細胞表面等。
若脫落(luo)現象(xiang)不嚴重應將細胞(bao)盡快(kuai)放回培(pei)養(yang)基(ji)繼(ji)續培(pei)養(yang)，若出現大(da)片(pian)脫落(luo)的現象(xiang)需(xu)要收集(ji)細胞(bao)重新消化吹(chui)散(san)再接種。
建議使用經TC處理后的培養(yang)器皿(min)培養(yang)細胞，如NEST細胞培養(yang)瓶、NEST細胞工廠等(deng)。




02.細胞本身偏嗜酸性，培養(yang)基(ji)消耗(hao)較快(kuai)

293T細(xi)胞在(zai)略(lve)偏酸(suan)性的(de)環境下生長狀(zhuang)態更好，在(zai)培養過(guo)程(cheng)中需要時刻注意(yi)培養基的(de)pH值。
在(zai)細(xi)胞密度達(da)到70%以上時，細(xi)胞培養基的消耗速度較快，需要時刻觀(guan)察并及時換液(ye)。


03.細胞生長(chang)時聚(ju)集成島

293T細(xi)胞(bao)生長時呈(cheng)島狀聚集生長，會逐步向外擴散直到完全融合(he)。


04.細胞聚集成團之(zhi)后很難再吹(chui)散

293T細胞(bao)傳代過(guo)程中(zhong)(zhong)一(yi)定要注意吹散細胞(bao)，同(tong)時接(jie)種(zhong)的密(mi)度不可過(guo)高(gao)。密(mi)度過(guo)高(gao)容易使(shi)細胞(bao)抱(bao)團(tuan)，導致(zhi)難(nan)以再次吹散，會(hui)在培(pei)養器皿中(zhong)(zhong)形成(cheng)類(lei)似(si)于球(qiu)狀的聚集體貼(tie)壁生(sheng)長(chang)。導致(zhi)即使(shi)培(pei)養條件合適細胞(bao)也難(nan)以生(sheng)長(chang)。




細胞培養


01.細胞(bao)凍(dong)存(cun)

1. 隨著傳代(dai)的次數增加(jia)，293T細胞(bao)會(hui)出現生長狀態下降，出現突(tu)變等(deng)現象。所以我們需要在細胞(bao)購進(jin)時(shi)就進(jin)行(xing)大量凍存，以保證(zheng)實驗的穩定性(xing)和持續性(xing)。
2. 在細胞(bao)對數生長(chang)期進行凍存，從而增加細胞復蘇成活率。
3. 倒去細胞上清(qing)液并洗去殘留的(de)培養基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后移除。
5. 鏡下觀察，當293T細(xi)胞變圓且細(xi)胞間(jian)間(jian)隙加大時，加入新鮮培養基吹打混勻。
6. 細胞(bao)計數(shu)。
7. 將(jiang)細胞離心，1000rpm，2min。
8.根據計數結(jie)果加入細胞(bao)凍存液重懸細胞(bao)，密(mi)度為(wei)3×10^6個/mL。
9. 將細胞(bao)重(zhong)懸液分裝進細胞(bao)凍(dong)存管，進行凍(dong)存。
10. 液氮氣象保(bao)存24小時后建(jian)議(yi)復蘇一(yi)管檢(jian)測細(xi)胞(bao)存活(huo)(huo)率，細(xi)胞(bao)狀態等，若細(xi)胞(bao)活(huo)(huo)性合(he)格可(ke)長期保(bao)存，若細(xi)胞(bao)活(huo)(huo)性合(he)格率低于80%建(jian)議(yi)重(zhong)新凍存。
注(zhu)：NEST生物樣本(ben)庫解決方案提供細胞(bao)凍存全流程產品，如NEST凍存管、NEST凍存液、NEST樣本(ben)管理(li)系統、NEST凍存架等。




02.細胞(bao)傳代

1. 當細(xi)(xi)胞生長至匯合率達(da)到80~90%需要對細(xi)(xi)胞進行傳代操作(zuo)，以(yi)擴(kuo)大細(xi)(xi)胞數量(liang)，維持細(xi)(xi)胞良好的(de)生長狀態。
2. 吸(xi)取干凈(jing)原有培養基，加入3-4mL常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20秒后舍棄PBS。
3. 加入適(shi)量(liang)胰酶(mei)，輕輕晃動細胞(bao)培養瓶使胰酶(mei)與細胞(bao)充(chong)分混勻，徹底消(xiao)化(hua)細胞(bao)。
4. 當細胞(bao)間隙(xi)變大，但并(bing)未完全脫落時(shi)在(zai)細胞(bao)培養(yang)瓶(ping)中加入培養(yang)基(ji)，終止消(xiao)化。混勻細胞(bao)，900rpm離心3-5分鐘后舍棄上清液(ye)。
5. 加入新的培養(yang)基重(zhong)選(xuan)細胞并均勻分到新的細胞培養(yang)瓶中，靜置培養(yang)。
6. 傳代完成(cheng)24小時后建議觀察(cha)細胞(bao)并換液，以去(qu)除死(si)亡細胞(bao)。 
注：NEST細(xi)(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)瓶規(gui)格齊全，表面經過TC處(chu)理，細(xi)(xi)胞(bao)貼壁效果(guo)極佳。同時NEST已(yi)推出新品細(xi)(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)基(ji)及細(xi)(xi)胞(bao)鹽溶(rong)液（PBS），助力(li)細(xi)(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)。



03.細胞(bao)復(fu)蘇

1. 當(dang)細胞(bao)(bao)傳代(dai)次數過(guo)多（超過(guo)50代(dai)），細胞(bao)(bao)狀態變差時(shi)(shi)或細胞(bao)(bao)出現污(wu)染事故(gu)時(shi)(shi)，需(xu)要丟棄原有細胞(bao)(bao)并對一開始(shi)凍存的細胞(bao)(bao)進(jin)行復蘇。
2. 打開(kai)水(shui)浴鍋，設置(zhi)溫度為40℃。
3. 查看NEST樣本管理(li)系統(tong)的記錄，根據記錄從液(ye)氮(dan)氣象中(zhong)取(qu)出凍存的細(xi)胞(bao)，迅速丟入水浴鍋中(zhong)并快速晃(huang)動，在(zai)1~2 min內使細(xi)胞(bao)溶液(ye)完全溶解。
4. 加入培養基中并混勻后轉入細胞培養瓶。
5. 放回37攝氏度(du)(du)、3%二氧(yang)化(hua)碳和95%相對濕度(du)(du)的培養箱中培養。
6. 第二天觀(guan)察細胞存活率。倒掉舊的(de)培養(yang)基(ji)，加入新鮮培養(yang)基(ji)。注：可使用耐思新推出細(xi)胞復(fu)蘇儀替代原始細(xi)胞復(fu)蘇過程，細(xi)胞復(fu)蘇時(shi)間(jian)短，細(xi)胞存活率高。




Q&A


01.細胞密度如何計算(suan)

常用(yong)(yong)的(de)細(xi)胞(bao)密度指細(xi)胞(bao)相對于最大生(sheng)長密度的(de)比值，貼(tie)壁細(xi)胞(bao)可以粗略的(de)用(yong)(yong)細(xi)胞(bao)所(suo)占(zhan)培養容(rong)器(qi)底(di)面積百分比表示，即顯微(wei)鏡下觀察培養容(rong)器(qi)底(di)部，有細(xi)胞(bao)的(de)區域(yu)占(zhan)總區域(yu)的(de)百分比值。
這(zhe)種計(ji)算方(fang)式優(you)點(dian)是直觀簡(jian)便(bian)，但受限于單個細胞在不(bu)同的(de)(de)生長密度時(shi)所占用的(de)(de)培養(yang)面積不(bu)同，導致計(ji)算并不(bu)嚴謹。


02.培養過程中細胞碎片較多

  • 細胞內的黑色顆粒是細胞外分(fen)泌泡以及(ji)細胞器(qi)的折光(guang)，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變。而細胞對培養環境不適應、缺乏營養、滲透壓有異常等均可能導致細胞內顆粒增加，建議適當改變培養條件。
  • 細胞外的黑色(se)顆粒為細胞碎片和細胞代謝(xie)產物，需要先舍棄(qi)原有培(pei)(pei)養基后用PBS潤洗清(qing)除細胞碎片(pian)，加(jia)入(ru)新的培(pei)(pei)養基后繼(ji)續培(pei)(pei)養。
    如(ru)果潤洗(xi)無法(fa)清除細胞碎片，可以等細胞密度處在70-80%左右時消化(hua)處理(li)細胞，終(zhong)止消化之(zhi)后混勻細(xi)胞，收(shou)集細(xi)胞懸(xuan)液在900-1000rpm條(tiao)件下(xia)離心3分鐘，舍棄上清液(ye)。重懸細胞→離心→再重懸后將細胞懸液接種到新的培養瓶。
    第二次PBS重懸是(shi)為了(le)去除碎片，如果碎片(pian)很多，建議(yi)用PBS多(duo)次潤(run)洗細胞。


03.細(xi)胞出現聚團現象(xiang)

  • 細(xi)胞(bao)傳代過程中(zhong)需要盡可能(neng)地吹散(san)細(xi)胞(bao)，并(bing)在(zai)顯微鏡下確認(ren)細(xi)胞(bao)基本分散(san)后再把細(xi)胞(bao)接種到培(pei)養(yang)瓶中(zhong)。
  • 優質的(de)(de)培養體系能有(you)效避免(mian)細胞(bao)吹散后在(zai)貼(tie)壁時再聚團(tuan)(tuan)的(de)(de)現象， 也(ye)可(ke)以減輕細胞(bao)聚團(tuan)(tuan)后無法(fa)重新攤開生長的(de)(de)癥(zheng)狀(zhuang)。
  • 培(pei)(pei)養(yang)過(guo)程(cheng)中輕微聚團(tuan)可以稍微延長消化時(shi)間(jian)，讓大團(tuan)細胞(bao)塊(kuai)下沉后吸取上層(ceng)的(de)分散細胞(bao)進行傳代。若聚團(tuan)過(guo)于(yu)嚴重建(jian)議重新(xin)培(pei)(pei)養(yang)或者(zhe)更換培(pei)(pei)養(yang)體系。