軟骨細胞培養指南
20世紀60年代(dai)起(qi)人們(men)對軟骨組織的研究進入(ru)到細胞(bao)水平。
1967 年 ManningWK 等使用(yong)胰蛋白酶聯合細菌膠原酶消化分離(li)與培(pei)養人軟(ruan)骨細胞獲得成功。
目(mu)前人(ren)軟(ruan)骨(gu)細胞(bao)體外分離與(yu)培養的(de)方法已被廣泛(fan)應用于(yu)軟(ruan)骨(gu)細胞(bao)生物學研(yan)究(jiu)，為(wei)骸骨(gu)軟(ruan)化癥、骨(gu)關(guan)節炎( osteoarthritis ， OA )等疾病的(de)防(fang)治及組(zu)織工程技術(shu)修復軟(ruan)骨(gu)缺損等研(yan)究(jiu)提供了重要的(de)方法學參(can)考。
人軟骨細胞特點
幼稚的軟骨細胞(bao)位于軟(ruan)骨(gu)組織的(de)表層，單個分布，體積較小(xiao)，呈(cheng)橢圓(yuan)(yuan)形(xing)(xing)，長軸(zhou)與軟(ruan)骨(gu)表面平行(xing)，越(yue)向深層的(de)軟(ruan)骨(gu)細(xi)(xi)胞體積之間(jian)增大呈(cheng)圓(yuan)(yuan)形(xing)(xing)，細(xi)(xi)胞核圓(yuan)(yuan)形(xing)(xing)或卵(luan)圓(yuan)(yuan)形(xing)(xing)，染色淺，細(xi)(xi)胞質弱嗜堿性，常見數量不一的(de)脂滴。
成(cheng)熟的軟骨細胞多2~8個成群分布(bu)于軟(ruan)骨(gu)(gu)陷窩(wo)內，這些(xie)軟(ruan)骨(gu)(gu)細(xi)胞(bao)由同(tong)一個母細(xi)胞(bao)分裂增(zeng)殖而(er)成，稱為(wei)同(tong)源細(xi)胞(bao)群。電鏡下，軟(ruan)骨(gu)(gu)細(xi)胞(bao)有突起(qi)和皺褶，細(xi)胞(bao)質(zhi)內有大(da)量(liang)的粗面內質(zhi)網(wang)和發達的高爾(er)基復合體(ti)及(ji)少量(liang)的線粒體(ti)。在(zai)組織切片中(zhong)，軟(ruan)骨(gu)(gu)細(xi)胞(bao)收(shou)縮(suo)為(wei)不規則形，在(zai)軟(ruan)骨(gu)(gu)囊(nang)和細(xi)胞(bao)之間出現較(jiao)大(da)的腔(qiang)隙。
軟骨細胞培養及傳代
圖A為原代細胞分離培養軟骨細胞貼壁后的形態，細(xi)胞呈多(duo)角型(xing)，扁平狀，胞質豐富，可(ke)見清晰(xi)、圓(yuan)形的細胞核，部(bu)分區軟骨(gu)細胞集落樣生長。
圖B為軟骨細胞傳代培養后的形態，細胞(bao)似橢圓形，細胞(bao)胞(bao)漿豐富。
隨傳代次數(shu)不(bu)斷增加，軟骨(gu)細(xi)胞(bao)集落中的梭(suo)形細(xi)胞(bao)數(shu)目逐漸增多。
為什么一傳代(dai)就變形？
在體外培養人軟骨細胞時，隨著傳代次數增加軟骨標志性蛋白(bai)Ⅱ膠(jiao)原(yuan)合成分泌(mi)減少，而(er)Ⅰ、Ⅲ型膠(jiao)原(yuan)合成分泌(mi)增多。
Ⅱ膠原的(de)合成(cheng)和(he)分泌是維持軟(ruan)骨細胞分化表型(xing)的(de)特(te)征性(xing)指標，提供了(le)軟(ruan)骨特(te)有(you)的(de)張力和(he)硬度。
軟骨(gu)中(zhong)的(de)其(qi)他分子與(yu)膠原蛋白結合形成網狀結構，支持軟骨(gu)具(ju)有一定的(de)彈性，對于軟骨(gu)維(wei)持形狀及承(cheng)載外來負荷起著非常重要的(de)作用。
所以，隨著傳代次數的增加，維(wei)持(chi)細胞(bao)形態(tai)的物(wu)質會(hui)逐漸減少，細胞(bao)的形態(tai)就會(hui)發生改變。
這種形態和功能的變化稱之為反分化現象，也是單層(ceng)傳代(dai)細(xi)胞的普遍現象。
軟骨(gu)細(xi)胞傳代方(fang)法(fa)
1. 低密度培養的軟骨細胞易發生去分化現象，一般最適接種密(mi)度為(wei)2~10×10^4/cm2;
2. 軟骨細胞代謝較為緩慢，無需增(zeng)加換液頻(pin)度，可能破(po)壞(huai)由細(xi)胞分(fen)泌而形成的群體(ti)化學環境。
傳代步(bu)驟
如果細胞密(mi)度達80%-90%，即可進行傳代培養。
1. 棄去培養上清，用(yong)不含(han)鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yang)(yang)瓶中(zhong)，置于37℃培養(yang)(yang)箱(xiang)中(zhong)消化1-2分鐘(zhong)，然后在顯微鏡下(xia)觀(guan)察細(xi)胞(bao)消化情況，若(ruo)細(xi)胞(bao)大部分變圓并(bing)脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下(xia)培養(yang)(yang)瓶后加少量培養(yang)(yang)基終止消化。
3. 按6-8ml/瓶補(bu)加培(pei)養基，輕輕打(da)勻(yun)后吸(xi)出(chu)，在1000RPM條(tiao)件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bu)加1-2mL培(pei)養液后吹勻(yun)。
4. 將(jiang)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)按1：2到(dao)1：5的比(bi)例分到(dao)新的含8ml培養基的新皿中或者瓶(ping)中。
